12月23日， 國際著名學術期刊Molecular Cell在線發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（生物化學與細胞生物學研究所）陳玲玲研究組關于環形RNA的最新研究進展：“RNA circles with minimized immunogenicity as potent PKR inhibitors”。通過對不同方式體外合成環形RNA的特性深入比較分析，該研究闡明了體外合成環形RNA免疫原性的問題及分子機制，并發現無免疫原性且具有雙鏈結構的環形RNA能夠高效抑制天然免疫因子PKR的激活，揭示體外合成環形RNA用于治療PKR異常激活相關自身免疫疾病的應用潛能。該工作為進一步研究環形RNA在天然免疫中的功能及機制奠定基礎，并為利用環形RNA進行炎癥性自身免疫病的干預治療提供了新途徑。

　　大多數環形RNA來自外顯子反向剪接，以共價鍵形成閉環結構。研究發現這類分子具有獨特的生成加工過程，不同于線性RNA的折疊構象，并具有高穩定性。這些特色使得環形RNA在基因表達調控中具有重要功能，包括參與信號轉導、細胞增殖、天然免疫調控等 (詳見綜述 Chen, Nat Rev Mol Cell Biol 2020)，并且具有獨特的應用潛能，如環形RNA通過雙鏈區域能夠抑制PKR的異常磷酸化 (Liu et al., Cell 2019)，可以作為翻譯載體用于功能性蛋白質的表達 (Wesselhoeft et al., Nat Commun 2018; Mol Cell 2019) 等。

　　需要指出的是，研究體外合成環形RNA的潛在應用需關注兩個重要問題，一是如何提高體外合成環形RNA的效率，二是合成的環形RNA是否具有免疫原性。一方面，近期研究報道指出體外合成的環形RNA能夠被天然免疫受體RIG-I所識別，進而引起細胞內天然免疫反應 (Chen et al., Mol Cell 2017; Mol Cell 2019)；而另一方面，也有研究者認為體外合成的環形 RNA 無免疫原性 (Wesselhoeft et al., Mol Cell 2019)，并指出細胞內免疫反應是由于環形RNA中存在微量線性RNA的污染導致。

　　為闡明這些重要問題，陳玲玲團隊首先比較了不同方式體外合成環形RNA的效率及免疫原性。目前已知體外合成環形RNA主要有兩種途徑：基于T4 RNA連接酶的催化直接分子內連接成環，以及基于I型內含子核酶進行自剪接成環。實驗結果表明，T4 RNA連接酶合成的環形RNA，包括可作為核酸適配體的環形RNA和可翻譯的環形RNA，均不會引起細胞內天然免疫反應，然而通過兩種不同I型內含子T4 bacteriophage和Anabeana自剪接形成的環形RNA均能夠引起細胞內天然免疫反應。

　　進一步對不同環化方式合成的環形RNA進行序列和二級結構的比較分析發現，基于T4 RNA連接酶合成的環形RNA，僅引入1到3個外源核苷酸，然而兩種I型內含子體外自剪接形成的環形RNA會分別引入74個或186個外源核苷酸?？蒲腥藛T利用改進的circSHAPE-MaP技術 (Liu et al., Cell 2019) 進一步解析了不同途徑合成的環形RNA二級結構，發現這些外源序列的引入會改變目的環形RNA的折疊構象，如與環形RNA內部序列配對，或外源序列自身形成了穩定的雙鏈結構。這些結果說明，I型內含子自剪接成環引入的外源序列可能是導致體外合成環形RNA引起細胞內天然免疫反應的原因。

　　陳玲玲研究組前期工作發現，在系統性紅斑狼瘡 (SLE) 病人來源的PBMC或T細胞中過表達含有16-26bp短的雙鏈結構的內源環形RNA可抑制PKR及疾病標志基因的異常激活 (Liu et al., Cell 2019)，提示體外合成無免疫源性且含有短的雙鏈結構的環形RNA有望成為治療自身免疫疾病的全新手段。目前已報道的抑制PKR異常磷酸化激活的小分子化合物，如 2-Aminopurine (2-AP)，oxindole/imidazole derivative compound 16 (C16) 等，均存在一定的局限性。例如，2‐AP存在其它激酶的非特性抑制，而C16 會被體內快速代謝清除且影響細胞正常增殖。研究人員發現通過T4 RNA連接酶合成的環形RNA，不僅免疫原性低，且保留了和體內相似的16-26bp短的雙鏈結構。進一步實驗證明，這類體外合成的環形RNA仍然能夠在體外及細胞內抑制PKR的激活，并且相對于小分子抑制劑具有約千倍以上更好的抑制效果。

　　綜上，該研究為進一步應用體外合成的環形RNA奠定了重要基礎，也為進一步研發基于環形RNA技術的核酸適配體和基因治療領域帶來可期前景。

　　分子細胞卓越中心玲玲研究組博士后劉楚霄博士和博士研究生郭思坤為該論文的共同第一作者，陳玲玲研究員為該論文的通訊作者。這項工作得到了中國科學院上海營養與健康研究院楊力研究員，陳玲玲組博士研究生徐奕鋒和楊力組南芳博士的大力支持，并得到來自中科院、科技部、基金委、HHMI以及科學探索獎的支持。

　　文章鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276521010091 

體外合成環形RNA的免疫原性機制和潛在應用